Alterações sistêmicas na assinatura do ciclo celular de pacientes com COVID-19 / Systemic changes in the cell cycle signature of patients with COVID-19

Com base nas perturbações fosfoproteômicas de moléculas associadas ao ciclo celular em células infectadas pelo coronavírus causador da síndrome respiratória aguda grave (SARSCoV)-2, a hipótese de inibidores do ciclo celular como uma terapia potencial para a doença de coronavírus 2019 (COVID-19) foi proposta. No entanto, o cenário das alterações do ciclo celular em COVID-19 permanece inexplorado. Aqui, realizamos uma análise integrativa de sistemas imunológicos de proteoma publicamente disponível (espectrometria de massa) e dados de transcriptoma (sequenciamento de RNA em massa e de célula única [scRNAseq]), com o objetivo de caracterizar mudanças globais na assinatura do ciclo celular de pacientes com COVID-19. Além de módulos de co-expressão de genes significativos enriquecidos associados ao ciclo celular, encontramos uma rede interconectada de proteínas diferencialmente expressas associadas ao ciclo celular (DEPs) e genes (DEGs) integrando dados moleculares de 1.480 indivíduos (974 pacientes infectados por SARS-CoV-2 e 506 controles [controles saudáveis ou indivíduos com outras doenças respiratórias]). Entre esses DEPs e DEGs estão várias ciclinas (CCNs), ciclo de divisão celular (CDCs), quinases dependentes de ciclinas (CDKs) e proteínas de manutenção de minicromossomos (MCMs). Embora os pacientes com COVID-19 compartilhem parcialmente o padrão de expressão de algumas moléculas associadas ao ciclo celular com outras doenças respiratórias, eles exibiram uma expressão significativamente maior de moléculas associadas ao ciclo celular relacionadas à gravidade da doença. Notavelmente, a assinatura do ciclo celular predominou nos leucócitos do sangue dos pacientes, mas não nas vias aéreas superiores. Os dados de scRNAseq de 229 indivíduos (159 pacientes com COVID- 19 e 70 controles) revelaram que as alterações das assinaturas do ciclo celular predominam nas células B, T e NK. Esses resultados fornecem uma compreensão global única das alterações nas moléculas associadas ao ciclo celular em pacientes com COVID-19, sugerindo novas vias putativas para intervenção terapêutica

Based on phosphoproteomics perturbations of cell cycle-associated molecules in severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV)-2-infected cells, the hypothesis of cell cycle inhibitors as a potential therapy for Coronavirus disease 2019 (COVID-19) has been proposed. However, the landscape of cell cycle alterations in COVID-19 remains mostly unexplored. Here, we performed an integrative systems immunology analysis of publicly available proteome (mass spectrometry) and transcriptome data (bulk and single-cell RNA sequencing [scRNAseq]), aiming to characterize global changes in the cell cycle signature of COVID-19 patients. Beyond significant enriched cell cycle-associated gene co-expression modules, we found an interconnected network of cell cycle-associated differentially expressed proteins (DEPs) and genes (DEGs) by integrating molecular data of 1,480 individuals (974 SARS-CoV- 2 infected patients and 506 controls [either healthy controls or individuals with other respiratory illness]). Among these DEPs and DEGs are several cyclins (CCNs), cell division cycle (CDCs), cyclin-dependent kinases (CDKs), and mini-chromosome maintenance proteins (MCMs). Although COVID-19 patients partially shared the expression pattern of some cell cycleassociated molecules with other respiratory illnesses, they exhibited a significantly higher expression of cell cycle-associated molecules associated with disease severity. Notably, the cell cycle signature predominated in the patients blood leukocytes but not in the upper airways. The scRNAseq data from 229 individuals (159 COVID-19 patients and 70 controls) revealed that the alterations of cell cycle signatures predominate in B, T, and NK cells. These results provide a unique global comprehension of the alterations in cell cycle-associated molecules in COVID-19 patients, suggesting new putative pathways for therapeutic intervention

Efeitos do ácido fólico não metabolizado na metilação global do DNA, na expressão de RNAm dos genes de DHFR, MTHFR, interferon-γ, TNF-α e interleucina-8, e na citotoxicidade das células NK / Effects of unmetabolized folic acid on global DNA methylation, on mRNA expression of DHFR, MTHFR, interferon-α, TNF-α and interleukin-8 genes, and on NK cells cytotoxicity

Com o início da fortificação de farinhas com ácido fólico (AF) no Brasil, a partir 2004, a população passou a estar exposta de modo compulsório a maiores quantidades desta vitamina. Sabe-se que o AF na sua forma sintética pode não ser completamente convertido para formas metabolicamente ativas, levando ao aparecimento de uma fração não metabolizada no organismo. Este fato é mais preocupante nos indivíduos que além da fortificação, fazem uso terapêutico dessa vitamina, como em pacientes com anemias hemolíticas (esferocitose hereditária (EH), ß-talassemia heterozigótica (ß-TH), entre outras). O objetivo desse estudo foi avaliar se as concentrações séricas de AF não metabolizado (UMFA) afetam a metilação global do DNA; a expressão de RNAm de genes da DHFR, MTHFR, interferon-γ, TNF-α e interleucina (IL)-8; e a citotoxicidade de células NK. Foram incluídos 27 pacientes com EH, 50 indivíduos com ß-talassemia heterozigótica (ß-TH) e 136 indivíduos saudáveis. Outros 30 indivíduos saudáveis foram incluídos num estudo de intervenção com 5mg/dia de AF durante 90 dias. Foram realizadas as análises de: ácido fólico sérico, eritrocitário e UMFA, vitamina B12, homocisteína total; expressões de RNAm dos genes de MTHFR, DHFR, IFN-γ, TNF-α e IL-8; citotoxicidade das células NK; metilação global do DNA e citocinas séricas IL6, IL-8, IL10, IFN-γ e TNF-α. Resultados: Os pacientes EH apresentaram maiores concentrações de AF (sérico, eritrocitário e UMFA) que seus controles, sendo que 55,5% (método microbiológico) e 74,1% (método LC-MS/MS) apresentaram concentrações suprafisiológicas da vitamina, e 74,1% apresentaram concentrações aumentadas de UMFA. No grupo ß-TH foi observado maiores concentrações de folato eritrocitário comparado ao controle e 22% dos indivíduos tinham concentrações suprafisiológicas de AF. No estudo de intervenção, após 45 e 90 dias de uso de AF as concentrações suprafisiológicas estavam presentes em 93,3% dos indivíduos e 100% deles apresentavam concentrações aumentadas de UMFA. Não foram observadas diferenças nas taxas de metilação global do DNA entre os grupos EH e ß-TH quando comparados aos seus controles e não foi verificada correlação entre metilação global e concentrações de UMFA. Tanto EH quanto ß-TH apresentaram maior expressão de RNAm de IL-8, quando comparados aos seus controles. No grupo de intervenção houve maior expressão de IL-8 após 45 dias de uso de AF quando comparado ao período pré-intervenção. Foi mostrada uma correlação inversa entre as concentrações de folato eritrocitário com o número de células NK no grupo EH e com a capacidade citotóxica das células NK no grupo total (EH + controle). No grupo intervenção foi observado menor número e menor capacidade citotóxica das células NK após 90 dias de uso de AF. Conclusões: O uso de AF 5mg/dia foi associado com aumento expressivo das concentrações de folato sérico, eritrocitário, UMFA, na expressão de RNAm de genes da citocina inflamatória IL-8 e redução do número e da citotoxicidade das células NK. Dessa forma, altas doses de AF podem resultar em alterações de componentes do sistema imune podendo prejudicar os mecanismos de vigilância celular das células NK. Os nossos achados sugerem que é importante o acompanhamento terapêutico dos pacientes que fazem uso de AF, especialmente aqueles indivíduos que fazem uso crônico desta vitamina por longo tempo, como os pacientes com anemias hemolíticas, mulheres que desejam engravidar e gestantes

With the beginning of the fortification of flour with folic acid (FA) in Brazil, since 2004, the population has been exposed compulsorily to larger amounts of this vitamin. It is known that FA in its synthetic form can not be completely converted to metabolically active forms, leading to the appearance of an unmetabolized fraction in the body. This fact is more worrying in subjects beyond fortification, make therapeutic use of this vitamin, such as patients with hemolytic anemia (hereditary spherocytosis (HS), ß-thalassemia heterozygotic (ß-TH), among others). The aim of this study was to evaluate if serum concentrations of unmetabolized FA (UMFA) affect the global DNA methylation; mRNA expression of DHFR, MTHFR, interferon-γ, TNF-α and interleukin (IL)-8 genes; and on cytotoxicity of NK cells. It was included 27 patients EH, 50 subjects ß-TH and 136 healthy subjects. Another 30 healthy subjects were included in an intervention study with 5 mg/FA daily during 90 days. Analyzes performed were: serum and erythrocyte folate, and UMFA, vitamin B12, tHcy; mRNA expression of MTHFR, DHFR, IFN-γ, TNF-α and IL-8 genes; cytotoxicity of NK cells; global DNA methylation and serum cytokines IL6, IL-8, IL10, IFN-γ and TNF-α. Results: EH patients presented higher FA concentrations (serum, erythrocytes and UMFA) than controls ones, and 55.5% (microbiologic method) and 74.1% (LC-MS/MS method) showed supraphysiologic concentrations of vitamin, and 74.1% presented increased concentrations of UMFA. In ß-TH group, it was observed higher erythrocyte folate concentrations compared with the control and 22% of subjects had supraphysiological concentrations of FA. In the intervention study, after 45 and 90 days of FA use, supraphysiological concentrations were present in 93.3% of subjects and 100% of them showed increased concentrations of UMFA. It was not observed differences in global methylation of DNA between EH and ß-TH groups when compared to their controls and it was not observed significant correlation between global DNA methylation and UMFA levels. Both EH and ß-TH showed higher mRNA expression of IL-8 gene, when compared to controls. In the intervention group, there was higher mRNA expression of IL-8 gene after 45 days of FA use when compared to pre-intervention period. It was demonstrated an inverse correlation between erythrocyte folate levels and the number of NK cells in EH group; and cytotoxic capacity of NK cells on total group (EH + control). In intervention group, it was observed fewer number and lower cytotoxic capacity of NK cells after 90 days of AF use. Conclusions: The use of AF 5mg daily was associated with a significant increase in serum and erythrocytes folate levels, accompanied by increase in UMFA levels, an increase in mRNA expression of IL-8 gene, and reduction of the number and the cytotoxicity capacity of NK cells. Thus, high doses of AF can result in modifications of the immune system components, which may damage the cell surveillance mechanisms of NK cells. Our findings suggest that is important the therapeutic follow up of patients that are using AF, especially those subjects with chronic use of this vitamin, such as patients with hemolytic anemia, women who wish to become pregnant and pregnant women

Analysis of NK cells in peripheral blood and tumor infiltrating lymphocytes in cervical cancer patients / Análisis de la población de células asesinas naturales (NK) en sangre periférica y en linfocitos infiltrantes de tumor en pacientes con cáncer de cuello uterino

Objective: To understand the biologic and clinical importance of intratumoral natural killer cells CD16+CD56+CD3 and NKT CD16+CD56+CD3 cells in immune surveillance against cervical cancer. Methods: To understand the significance of NK (CD16+CD56+CD3-) and NKT (CD16+CD56+CD3-) in immune surveillance against cervical cancer, we analysed 39 peripheral blood and 30 biopsy samples from cervical cancer patients, and 40 peripheral blood and 5 biopsy samples from healthy women with normal cytology. The frequencies of NK and NKT and HLA-I expression in keratinocytes were analysed by flow cytometry. Results: In peripheral blood, a higher frequency of NK was observed in the patient group compared with the controls (p=0.002). However, this increase was not reflected in TILs (p=0,095). A significant reduction of HLA-I expression was observed in the patient group compared to the control group (p=0.019). A low number of NK infiltrated was observed in tumors of patients with HLA-I down regulation, but it was not significant (p=0.374). A low number of NK infiltration was associated with shorter survival, but it was not significant (p=0.275). Conclusions: Our results show that although in peripheral blood an increase in NK population was observed in patient group, this increase was not reflected in TILs. It is possible that this inefficient migration of NK´s into the tumor milieu could be related to the expression of immunosuppressive cytokines, in particular IL-10.

Objetivo: Entender la importancia biológica y clínica de las células intratumorales natural killer (NK) CD16+CD56+CD3- y de las células natural killer T (NKT) CD16+CD56+CD3- en la inmunovigilancia del cáncer de cuello uterino (CCU). Métodos: Para comprender el papel de las NK (CD16+CD56+CD3-) y de las células natural killer T (NKT) (CD16+CD56+CD3-) en la inmunovigilancia del CCU, se analizaron 39 muestras de sangre periférica (SP) y 30 biopsias de pacientes con CCU, así como de 40 muestras de SP y 5 biopsias de cuello uterino de mujeres con citología normal. Las frecuencias de NK y NKT y la expresión de HLA-I se analizaron por citometría de flujo. Resultados: Se observó una mayor frecuencia de NK en SP en el grupo de pacientes comparado con el grupo control (p = 0,002). Sin embargo, este aumento no se reflejó en TIL (p = 0,095). Una reducción significativa de HLA-I se observó en el grupo de pacientes (p = 0,019). Esta disminución se asoció una disminución en el número de NK, pero no fue significativa (p = 0,374). Un bajo número de NK se asoció con una menor supervivencia, pero no fue significativo (p = 0,275). Conclusiones: Nuestros resultados muestran que aunque en SP se observa un incremento de NK, este no se refleja en los TIL. Es posible que este tráfico ineficiente de células NK hacia el tumor esté alterado por la expresión de citoquinas inmunosupresoras, en particular IL-10.